摘要 4-6 Abstract 6-7 第一章 前言 12-26 1.1 马铃薯近况介绍 12-13 1.1.1 马铃薯概述 12 1.1.2 世界马铃薯生产近况 12 1.1.3 马铃薯探讨趋势 12-13 1.1.4 世界马铃薯贸易 13 1.1.5 我国马铃薯生产 13 1.2 有害生物风险略论(PRA) 13-15 1.2.1 有害生物风险略论(PRA)探讨近况 13-15 1.2.1.1 有害生物风险略论措施分类 14-15 1.2.1.1.1 有害生物定性风险评估措施 14 1.2.1.1.2 有害生物定量风险评估措施 14-15 1.2.1.2 有害生物风险略论软件工具 15 1.2.2 国内有害生物风险略论(PRA)探讨情况 15 1.3 马铃薯病毒病 15-19 1.3.1 植物病毒简介 15-16 1.3.2 马铃薯的退化 16 1.3.3 马铃薯病毒 16-19 1.3.3.1 马铃薯M病毒 17 1.3.3.2 马铃薯纺锤块茎类病毒 17-18 1.3.3.3 番茄斑萎病毒 18 1.3.3.4 马铃薯S病毒 18-19 1.4 马铃薯病毒检测探讨概况 19-23 1.4.1 生物学试验措施 19 1.4.2 电子显微镜技术 19-20 1.4.3 免疫学措施 20-21 1.4.3.1 双抗体夹心法 20 1.4.3.2 硝酸纤维素膜法 20-21 1.4.3.3 快速酶联免疫吸附法 21 1.4.4 分子生物学检测措施 21-23 1.4.4.1 聚合酶链式反应(PCR) 21-22 1.4.4.1.1 PCR和RT-PCR 21-22 1.4.4.1.2 PCR反应的作用因素 22 1.4.4.2 核酸斑点杂交技术 22 1.4.4.3 双链RNA技术 22-23 1.4.4.4 基因芯片技术 23 1.5 马铃薯病毒病防治策略探讨概况 23-24 1.6 试验目的与意义 24-26 1.6.1 从法国、俄罗斯、荷兰引种马铃薯目的与意义 24 1.6.2 引种过程中有害生物风险略论意义 24-25 1.6.3 马铃薯病毒检测技术探讨目的及意义 25-26 第二章 马铃薯有害生物风险略论 26-45 1.进境马铃薯有害生物风险略论措施 26-32 1.1 起始阶段 26 1.2 评估阶段 26-32 1.3 管理阶段 32 2.进境马铃薯有害生物风险略论结果 32-43 2.1 法国进境马铃薯有害生物风险略论 32-35 2.1.1 法国进境马铃薯上有害生物的确定 32-33 2.1.2 法国进境马铃薯上限定的有害生物名单 33-34 2.1.3 法国进境马铃薯上QP和RNOP的确定 34-35 2.2 荷兰进境马铃薯有害生物风险略论 35-39 2.2.1 荷兰进境马铃薯上有害生物的确定 35-36 2.2.2 荷兰进境马铃薯上限定的有害生物名单 36-37 2.2.3 荷兰进境马铃薯上QP和RNQP的确定 37-39 2.3 俄罗斯进境马铃薯有害生物风险略论 39-42 2.3.1 俄罗斯进境马铃薯上有害生物的确定 39 2.3.2 俄罗斯进境马铃薯上限定的有害生物名单 39-40 2.3.3 俄罗斯进境马铃薯上QP和RNQP的确定 40-42 2.4 风险管理方案及其效率评估 42-43 2.4.1 检疫审批和产地检疫证明 42-43 2.4.2 种薯质量要求及必要处理 43 2.4.3 入境检疫和隔离试种 43 2.4.4 脱毒苗的引进 43 3.讨论 43-45 3.1 本探讨中有害生物风险略论的科学性 43-44 3.2 本探讨中有害生物风险略论的问题 44-45 第三章 马铃薯病毒检测技术探讨 45-68 1.材料与措施 45-51 1.1 主要试剂盒仪器 45-46 1.1.1 试剂 45 1.1.2 仪器 45-46 1.1.3 常用缓冲液配方 46 1.2 供试材料 46-47 1.2.1 材料的采集 46 1.2.2 DAS-ELISA检测材料带毒情况 46-47 1.2.3 供试材料保存 47 1.3 马铃薯病毒RNA提取 47-48 1.3.1 试剂盒提取植物总RNA 47-48 1.3.2 RNAiso Plus试剂提取总RNA 48 1.3.3 总RNA完整性的检测 48 1.4 马铃薯病毒RT-PCR的检测 48-51 1.4.1 马铃薯病毒引物的设计 48 1.4.2 马铃薯病毒RT-PCR检测体系的建立 48-50 1.4.3 三种马铃薯病毒RT-PCR体系优化 50 1.4.3.1 PVM单重RT-PCR体系的优化 50 1.4.3.2 TSWV单重RT-CPR体系的优化 50 1.4.3.3 PSTVd单重RT-CPR体系的优化 50 1.4.4 RT-PCR产物回收及测序 50-51 1.4.5 双重RT-PCR体系检测 51 1.4.6 三重RT-PCR体系检测 51 2.试验结果与略论 51-64 2.1 病毒RNA提取 51-52 2.2 马铃薯病毒RT-PCR检测 52-60 2.2.1 PVM、TSWV、PSTVd的单重RT-PCR检测 52-55 2.2.1.1 退火温度的作用 52-53 2.2.1.2 Mg~(2/)浓度对PCR的作用 53-54 2.2.1.3 cDNA量对PCR扩增的作用 54-55 2.2.2 PVM、TSWV、PSTVd、PVS的双重RT-PCR检测 55-58 2.2.2.1 反转录体系中不同下游引物加入量的优化 55-57 2.2.2.2 PCR体系中Mg~(2/)浓度的优化 57-58 2.2.3 PVM、PVS、TSWV、PSTVd的三重RT-PCR检测 58-60 2.2.3.1 反转录体系中不同下游引物量的优化 58-59 2.2.3.2 PCR体系中Mg~(2/)浓度的优化 59-60 2.3 RT-PCR扩增产物测序 60-64 2.3.1 PSTVd比对结果及测序报告 60-61 2.3.2 TSWV比对结果及测序报告 61 2.3.3 PVM比对结果及测序报告 61-62 2.3.4 不同PVM引物RT-PCR扩增后的测序结果 62-64 3.讨论 64-68 3.1 PVM供试材料可能为病毒新株系的猜测 64 3.2 TSWV和PSTVd双重RT-PCR检测中的问题 64-66 3.3 RT-PCR检测技术的运用 66 3.4 RT-PCR检测法和ELISA检测法比较 66 3.5 马铃薯病毒RT-PCR检测 66-67 3.5.1 反转录种不同病毒下游引物量 66-67 3.5.2 Mg~(2/)浓度的作用 67 3.5.3 多重RT-PCR退火温度的选择 67 3.6 RT-PCR产物的克隆和测序 67-68 第四章 创新与展望 68-69 创新 68 展望 68-69 参考文献 69-73 致谢 73-74 附录 74-80 攻读学位期间发表的学术论文 80 |
