| 【摘要】：德国小蠊(Blattella germanica)是一种危害日趋严重的世界性卫生害虫,控制其种群数量目前仍以化学杀虫剂为主,其中拟除虫菊酯类杀虫剂运用最为广泛,但抗药性已成为制约其持续使用的严重障碍,迫切需要对德国小蠊的抗药性机理进行更加深入系统的探讨。本论文以在实验室筛选的抗高效氯氰菊酯品系德国小蠊为探讨对象,从代谢酶活性、蛋白质组学、肠道菌群的组成变化等多个角度揭示德国小蠊的抗药性机理,并进一步研讨了抗药性对德国小蠊生物适合度及抗真菌感染的作用。获得了以下结果： 1.利用单一杀虫剂高效氯氰菊酯在30%-50%的选择压下持续对德国小蠊敏感品系(Sensitive, S)进行筛选,经连续筛选11代后,获得抗药性系数为7.4,达到中度抗性的德国小蠊高效氯氰菊酯抗性品系(Resistant, R)。从R品系筛选过程来看,德国小蠊对高效氯氰菊酯抗药性的增长呈现出先慢后快的增长趋势,表明德国小蠊抗药性基因的纯合过程；交互抗性测定显示,R品系与其他拟除虫菊酯类杀虫剂(高效氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯)具有明显的交互抗性,抗性系数分别为5.6、4.1、3.7,而与有机磷(毒死蜱)以及氨基甲酸酯类(残杀威)具弱的交互抗性,抗性系数仅为1.8和1.5。 2.收集1ppm高效氯氰菊酯诱导前后的S品系以及R品系德国小蠊雄虫血淋巴,测定血淋巴中超氧化物歧化酶(SOD)、乙酰胆碱酯酶(AChE)和谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)三种酶活性的变化。结果发现,R品系SOD、AChE以及GST三种酶的活性均比S品系要高,酶活力分别高出4.9%±0.2%、2.9%±0.4%和30.3%±1.1%,其中GSTs活性异同达到极显著水平(P0.01)；经高效氯氰菊酯诱导后,两品系SOD和GSTs活性均有不同程度的升高,S品系和R品系SOD活性分别升高6.7%±0.3%和5.4%±0.6%,GSTs活性分别升高23.6%±0.8%和26.9%±1.6%,说明SOD和GSTs在德国小蠊高效氯氰菊酯抗性中可能起一定影响。 3.以丙酮为溶剂对德国小蠊成虫进行脱脂处理,并利用TCA/丙酮、RIPA裂解液、Tris-HCl、1%SDS和裂解液五种蛋白提取液提取全虫蛋白,通过Bradford法测定蛋白浓度,SDS-PAGE电泳比较脱脂前后各种蛋白提取措施的提取效果。结果表明：脱脂处理有助于德国小蠊成虫蛋白的提取；五种蛋白提取措施中,RIPA裂解液对成虫蛋白提取效果最好,雌雄成虫蛋白浓度分别为14.2mg/ml和12.3mg/ml,电泳后蛋白条带分别为13条和16条,其次分别为SDS、Tris-HCl及裂解液,TCA/丙酮沉淀提取法效果最差,几乎无可见条带。进一步探讨发现,S品系的雄虫全蛋白及血淋巴蛋白浓度均低于R品系,SDS-PAGE图谱上出现多条异同蛋白带,分子量主要集中在90KD-27KD之间,其中90KD、78KD及55KD等蛋白带在R品系中表达量异常增高,可能与抗性的形成有关；经1ppm高效氯氰菊酯诱导后,S品系蛋白浓度明显下降(P0.05),R品系没有明显变化,可能与杀虫剂抑制了S品系部分蛋白的表达有关；SDS-PAGE图谱也出现多条异同蛋白带,主要集中在118KD及20KD附近,推测该异同蛋白多与德国小蠊对杀虫剂的应激性有关,部分可能参与抗性形成。 4.分别对德国小蠊S品系及R品系血淋巴蛋白进行双向电泳(2D-PAGE),并对电泳图谱进行异同略论。结果表明：S品系及R品系血淋巴蛋白表达存在显著异同,共出现111个异同点,其中R品系中蛋白表达上调点有64个,表达下调点有47个。在2D图谱上挑取29个异同显著的蛋白质点(量值≥2)进行质谱鉴定,共成功鉴定出22个,主要为防御/免疫相关的蛋白质：一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS),转铁蛋白(transferrin, Tf);营养/能量代谢相关的蛋白质：α-淀粉酶(alpha-amylase),磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase), Per a3,ATP-结合蛋白(ATP-binding protein),精氨酸激酶(arginine kinase, AK),以及其他功能未知蛋白。通过对电泳图谱以及质谱结果的略论,明确了部分异同蛋白的功能,并对其与德国小蠊高效氯氰菊酯抗性之间的关系进行了推测。 5.对1ppm高效氯氰菊酯诱导后的德国小蠊S品系及R品系血淋巴蛋白同样进行了双向电泳(2D-PAGE)略论,结果表明：亚致死剂量高效氯氰菊酯诱导后引起两品系血淋巴蛋白的显著变化。两品系经诱导后,共出现203个异同点。S品系在诱导前后,出现148个异同点,其中蛋白表达上调点有67个,表达下调点有81个；R品系在诱导前后共出现65异同点,其中蛋白表达上调点有61个,表达下调点有4个；选取65个异同显著蛋白点(量值≥2)进行质谱鉴定,共鉴定出24个,按功能分为防御/免疫相关的蛋白质：热休克蛋白20(heat shock protein, hsp20)、一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS),转铁蛋白(transferrin, Tf);解毒蛋白：谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferases, GSTs);营养/能量代谢的蛋白质：Per a3,α-淀粉酶(alpha-amylase),精氨酸激酶(arginine kinase, AK),以及其他功能未知蛋白。 6.比较德国小蠊S品系和R品系在产卵荚率、卵夹脱落率、孵化率、雌雄虫比例(雄/雌)、幼虫生长历期以及雌雄虫重量等方面的异同,并计算抗性品系的相对适合度变化。结果表明,R品系德国小蠊卵荚脱落率降低50%±1.7%,幼虫孵化率降低30%±0.85%,生长历期延长7d,雄虫/雌虫增加36%±1.02%,雌虫寿命缩短6.5d,雄虫成虫体重减轻0.0037±0.0004g,雌虫体重减轻0.0063±0.0006g。异同均达到极显著水平。德国小蠊R品系相对生物适合度仅为0.26,与S品系相比,显示出明显的适合度缺陷。 7.剖取羽化后7～8d两品系雌性德国小蠊卵巢,利用TCA/丙酮法提取卵巢蛋白,进行双向电泳,并进行异同蛋白点略论。结果发现：S品系和R品系卵巢蛋白在双向凝胶图谱中具有明卵巢蛋白在2D图谱上具有明显异同,共检测到64个异同蛋白点,有18个蛋白质点表达上调,46个蛋白点表达量下调,其中有24个蛋白质点异同达到显著水平(量值≥2)；对异同显著蛋白点进行质谱鉴定,共成功鉴定出17个,其中有5个为卵黄蛋白(vitellogenin);1个为热休克蛋白(heat shock protein, hsp),1个核糖体蛋白(Stubarista, sa),1个昆虫表皮蛋白(putative cuticular protein, ICPG),1个转铁蛋白(transferrin, Tf),1个肌激酶(adenylate kinase, adkl),1个醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase),其他为未知功能蛋白。通过对卵巢蛋白质组的略论,初步明确了部分蛋白极有可能在降低德国小蠊生物适合度降低机制中起到重要影响。 8.利用孢子接种试验,比较了德国小蠊S品系和R品系对昆虫病原真菌-白僵菌(Beauveria bassiana)的易感性,并对两品系可培养肠道菌群的组成进行了初步略论。结果表明：德国小蠊S品系和R品系对白僵菌的易感程度存在明显异同,相比较S品系,R品系德国小蠊更容易受白僵菌感染(P0.05)；可培养的肠道菌群组成也发生变化,从S品系德国小蠊肠道中共培养出29株菌,经生理生化指标鉴定,分别属于肠杆菌科(9株)、假单胞菌科(6株)、链球菌科(5株)、芽孢杆菌科(4株)、奈瑟氏球菌科(2株)、微球菌科(2株)及乳杆菌科(1株)；与S品系相比,R品系分离到的肠道菌株数较少,共分离出25株菌,其中肠杆菌科,芽孢杆菌科均少1株,假单胞杆菌科少2株。 9.利用平板抑制法对德国小蠊抗病原真菌肠道菌进行筛选,共获得3株对白僵菌具有明显抑制影响的菌株。通过其生理生化指标以及16S rDNA序列信息,构建系统发育树,发现3株菌分别为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeu)以及Pseudomonas reactanS。3株菌均可明显的抑制白僵菌的生长,其中枯草芽孢杆菌对白僵菌的抑制效果最强,抑菌圈直径达32mm；进一步探讨发现,细菌发酵液可以显著降低体外白僵菌孢子的发芽率(发芽率降低14.5%,P0.05),并抑制真菌菌丝的生长,造成菌丝出现空泡状畸形,最终从空泡处破溃引起原生质外流,引发真菌死亡。用甲醇粗提细菌发酵液并饲喂德国小蠊,背板点滴法接种真菌孢子,引起德国小蠊发病时间明显延长,死亡率降低,并且随着孢子浓度越低,粗提物保护影响越明显,当孢子浓度为4×108CFU/ml时,对照组第20d的累计死亡率达62.3%±1.3%,处理组仅为49.5%±1.85%,降低了12.8%,异同达到极显著水平,该探讨不仅表明德国小蠊肠道菌可能在抗病原真菌感染中起到一定的影响,还提示探讨者今后可在昆虫肠道这一特殊环境中寻找具有潜在药用价值的细菌菌株用以防治真菌病。 |
