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【摘要】：木耳(A uricularia auricula)是兼具食用价值与药用价值的食用菌之一,具有很大的探讨价值。但是由于日前全面停止商业采伐,导致木耳生长所需的木屑原料出现短缺,更有可能导致木耳产业的停滞。我国是农业大国,每年有大量的农业秸秆产生,秸秆的成分主要是半纤维素,而木耳是木腐菌,降解纤维素的能力很强,对半纤维素的降解能力较弱,想要利用农业秸秆中的半纤维素就需要提高木耳降解半纤维素的能力,半纤维素的降解主要由p-1,4-内切木聚糖酶、p-木糖苷酶、a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸苷酶以及乙酰木聚糖酯酶的协同影响完成,其中a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶影响于半纤维素的侧链,在半纤维素降解过程中具有重要的影响。本探讨对木耳体内的a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因进行探讨,以期得到a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因的表达蛋白,提高a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因在木耳体内的表达量,主要探讨了以下几个内容。(1)对实验室保存的木耳栽培菌株DL202提取其总RNA并进行RNA-Seq技术略论。基于木耳转录组数据,筛选出在半纤维素降解过程中具有重要影响的a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因,利用RACE技术克隆全长并进行生物信息学略论。最终筛选出的a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因为Unigene3150,简称α-af基因,参与第21条代谢通路。成功获得了长为1953bp的完整开放阅读框,其编码的蛋白为71.19kD,等电点为5.23,有信号肽,无跨膜区,亚细胞定位为分泌蛋白。(2)将得到的a-af基因全长序列构建载体后进行原核表达,并利用SDS-PAGE技术检测诱导表达结果。结果表明原核表达载体pET-32a-α-αf构建成功,并且成功表达出与预测大小相符的蛋白。(3)探讨了采用5种不同的碳源：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、D-木糖和L-阿拉伯糖培养木耳菌丝后对木耳体内的α-af基因相对表达量的作用。结果表明经麦芽糖和L-阿拉伯糖诱导后的木耳菌丝体内的a-af基因相对表达量较高,分别达到了对照的4.53和5.10倍。综上所述,基于木耳DL202的转录组数据,克隆得到了a-af基因的全长并成功表达,探讨得列对α-af基因诱导效果最好的碳源为L-阿拉伯糖。为提高木耳降解半纤维素的能力提供了理论基础,同时为采用农业秸秆代替木屑栽培木耳提供了科学依据。
【关键词】：木耳 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶 克隆 原核表达 qRT-PCR
摘要3-4 Abstract4-9 1 绪论9-19 1.1 课题探讨的目的和意义9-10 1.2 国内外探讨近况10-18 1.2.1 半纤维素酶概述10 1.2.2 木聚糖酶探讨进展10-11 1.2.3 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶探讨进展11-13 1.2.4 转录组探讨进展13-17 1.2.5 RACE技术探讨进展17-18 1.2.6 实时荧光定量PCR的探讨进展18 1.3 论文的主要探讨内容18-19 2 木耳α-af基因全长克隆及生物信息学略论19-40 2.1 材料和措施19-26 2.1.1 试验材料19 2.1.2 供试培养基19 2.1.3 主要仪器和试剂19-20 2.1.4 引物20 2.1.5 木耳总RNA提取20-21 2.1.6 RNA完整性和质量检验21 2.1.7 基因筛选21 2.1.8 反转录RT-PCR得到cDNA21-22 2.1.9 α-af基因片段的扩增22 2.1.10 目的片段胶回收22-23 2.1.11 目的片段的克隆测序23-24 2.1.12 5’RACE cDNA和3'RACE cDNA第一链合成24-25 2.1.13 5’RACE25 2.1.14 3 ’RACE25-26 2.1.15 木耳α-af基因全长克隆26 2.1.16 木耳α-af生物信息学略论26 2.2 结果与略论26-39 2.2.1 RNA提取结果26-27 2.2.2 基因筛选结果27-28 2.2.3 α-af基因片段扩增结果略论28-29 2.2.4 α-af基因5'RACE结果略论29 2.2.5 α-af基因3'RACE结果略论29 2.2.6 木耳α-af基因全长克隆结果略论29-30 2.2.7 木耳α-af基因的生物信息学略论30-36 2.2.8 木耳α-af蛋白二级结构预测36-37 2.2.9 木耳α-af蛋白三级结构预测37-38 2.2.10 木耳α-af基因序列亲缘性略论38-39 2.3 本章小结39-40 3 木耳α-af基因原核表达40-45 3.1 材料和措施40-43 3.1.1 试验材料40 3.1.2 主要仪器和试剂40 3.1.3 引物40 3.1.4 木耳α-af基因扩增并转化大肠杆菌感受态DH5α40-41 3.1.5 pMD18-T-α-af质粒提取41 3.1.6 质粒双酶切41-42 3.1.7 重组载体pET-32a-α-af构建42 3.1.8 木耳α-af基因的原核表达42-43 3.2 结果与略论43-44 3.2.1 pMD18-T-α-af质粒双酶切检验43 3.2.2 重组载体pET-32a-α-af双酶切检验43-44 3.2.3 重组载体的SDS-PAGE检测44 3.3 本章小结44-45 4 不同碳源对木耳α-af基因相对表达量的作用45-51 4.1 材料和措施45-47 4.1.1 试验材料45 4.1.2 供试培养基45 4.1.3 仪器及试剂45-46 4.1.4 引物46 4.1.5 菌丝RNA提取46 4.1.6 qRT-PCR模板cDNA制作46-47 4.1.7 qRT-PCR47 4.2 结果与略论47-49 4.2.1 RNA质量检测47-48 4.2.2 qRT-PCR结果48-49 4.3 本章小结49-51 结论51-52 探讨展望52-53 参考文献53-59 攻读学位期间的学术论文59-60 ，阿拉伯语专业论文，阿拉伯语论文题目 |
