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【摘要】：外壁内层是花粉壁的保守结构。之前的探讨表明，拟南芥AT-hook/PPCdomain家族蛋白TEK是控制花粉外壁内层发育的关键基因。在其T-DNA插入突变体中，花粉外壁内层缺失。在本文中，我们发现TEK特异调控阿拉伯半乳糖蛋白AGP的表达，从而作用花粉外壁内层的发育。TEK-SRDX转基因植株与tek突变体植株表型一致，表明TEK是调控外壁内层发育的转录激活因子。凝胶电泳迁移率实验表明TEK能够直接结合核基质附着区。基因芯片筛选到661个TEK下游基因，阿拉伯语论文网站，其中包括四个AGP家族基因，AGP6, AGP11, AGP23and AGP40。定量RT-PCR实验验证了这四个基因在tek突变体中下调。TEK-Flag互补材料用来进行染色质免疫共沉淀实验。结果表明，TEK蛋白在这四个基因的启动子上有富集。AGP6是TEK的靶位点之一。凝胶电泳迁移率实验证明TEK可以直接结合在AGP6的启动子上。AGP6的点突变体变现为育性降低的表型，并且花粉外壁内层的发育有缺陷。在tek突变体背景下，阿拉伯语毕业论文，用TEK启动子驱动AGP6基因可以部分恢复花粉外壁内层发育和植株的育性。这些结果表明，TEK直接调控AGPs的表达作用花粉外壁内层的发育。花粉外壁内层可能是由AGP和其他糖蛋白组成。
【关键词】：雄性不育 花粉外壁内层 AT-hook家族 阿拉伯半乳糖蛋白
中文摘要4-5 Abstract5-9 1 前言9-35 1.1 花粉壁的结构和发育及重要意义9-15 1.1.1 花粉壁的结构9-10 1.1.2 花粉壁的成分10-11 1.1.3 花粉壁的发育过程11-12 1.1.4 花粉壁发育相关基因12-14 1.1.4.1 初生外壁发育相关基因12-13 1.1.4.2 花粉外壁发育相关基因13-14 1.1.5 小结和展望14-15 1.2 AT-hook 蛋白及其功能探讨15-25 1.2.1 AT-hook 蛋白基序的发现及特征15-17 1.2.2 AT-hook 蛋白基序的类型17-18 1.2.3 AT-hook 蛋白基序与 DNA 的结合能力18 1.2.4 AT-hook 蛋白与 DNA 的特异结合18-19 1.2.5 AT-hook 蛋白质在动植物中的运用19-20 1.2.6 拟南芥 AHL 家族20-23 1.2.7 拟南芥 TEK 基因特异调控花粉外壁内层发育23-25 1.2.8 小结和展望25 1.3 阿拉伯半乳糖蛋白及其功能25-35 1.3.1 AGPs 的结构25-28 1.3.2 AGPs 及其 GPI 锚定结构28-29 1.3.3 AGPs 在植物器官和组织中的表达29 1.3.4 AGPs 在植物细胞中的表达29-30 1.3.5 AGPs 在植物生长发育中的功能30-31 1.3.6 拟南芥相关 AGPs 突变体探讨31-33 1.3.7 小结与展望33-35 2 材料与措施35-56 2.1 材料35-38 2.1.1 植物材料35 2.1.2 菌株和质粒35 2.1.2.1 菌株35 2.1.2.2 质粒载体35 2.1.3 抗生素35-36 2.1.4 试剂36 2.1.5 培养基配方36-37 2.1.6 仪器37-38 2.2 实验措施38-56 2.2.1 拟南芥的种植38 2.2.2 tek 突变体的鉴定38 2.2.3 半薄切片观察拟南芥花药发育38-40 2.2.3.1 试剂38-39 2.2.3.2 半薄切片实验步骤39-40 2.2.4 透射电镜观察40-41 2.2.5 扫描电镜观察41 2.2.6 亚历山大染色41-42 2.2.7 大肠杆菌 TOP10 感受态细胞的制备42-43 2.2.8 大肠杆菌的转化43 2.2.9 农杆菌感受态细胞的制备43 2.2.10 农杆菌的转化43-44 2.2.11 拟南芥的转化44 2.2.12 质粒的小量抽提44-45 2.2.13 拟南芥基因组 DNA 的抽提45 2.2.14 拟南芥 RNA 的抽提和反转录45-46 2.2.15 RNA 反转录合成 cDNA 第一链46 2.2.16 定量 RT-PCR46-47 2.2.17 芯片略论47 2.2.18 原位杂交47-51 2.2.19 染色质免疫共沉淀（ChIP）51-53 2.2.20 原核表达53-54 2.2.20.1 制备原核表达感受态细胞53 2.2.20.2 TEK-His 融合蛋白的表达和纯化53-54 2.2.21 凝胶电泳迁移率实验（EMSA）54 2.2.22 实验引物及用途54-56 3 实验结果56-73 3.1 TEK在拟南芥 Col 生态型中是一个转录激活型的调控因子56-58 3.2 TEK 通过 AT-hook 基序体外结合 MAR 序列58-60 3.3 芯片略论揭示 TEK 调控的细胞壁相关基因60-62 3.4 染色质免疫共沉淀实验说明 TEK 直接调控 AGP 基因的表达62-66 3.5 AGP6 的 EMS 诱变突变体表现为育性降低和外壁内层发育缺陷66-69 3.6 AGP6 在小孢子母细胞，绒毡层和花粉粒中表达69-70 3.7 在 tek 突变体中表达 AGP6 能够部分恢复花粉外壁内层的发育70-71 3.8 TEK 与 AHL1 的蛋白相互影响71-73 4 讨论73-78 4.1 AGP 蛋白可能是花粉外壁内层的主要组成成分73-75 4.2 花粉外壁内层保护小孢子避免破裂75-76 4.3 TEK 直接调控 AGPs 的表达控制花粉外壁内层的发育76-78 参考文献78-90 文章目录90-91 |
