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【摘要】：在自然界木聚糖是仅次于纤维素的第二大丰富的多聚糖。木聚糖的结构非常复杂，其主链是D-吡喃木糖通过β-1,4糖苷键连接形成，侧链上还连接有阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、阿魏酸酯基、乙酰基等不同的取代基，因此，阿拉伯语论文网站，木聚糖的完全降解需要多个酶的共同影响才能完成。其中，木聚糖酶作为主酶以内切的方式影响于木聚糖的主链，阿拉伯呋喃糖苷酶则是侧链降解酶，并对主链的降解起到重要的促进影响。本论文以已报道的来源于Paenibacillus sp. E18的一个同时具有木聚糖酶和葡聚糖酶活性的单结构域双功能木聚糖酶XynBE18为材料，针对其独特的催化机制及其与两个阿拉伯呋喃糖苷酶的协同影响进行初步探讨，从而为木聚糖的充分降解和有效利用提供科学依据。
基于序列比对，来源于Anoxybacillus sp. E2的第10家族木聚糖酶XynE2（该酶只有木聚糖酶活性而无葡聚糖酶活性）与XynBE18的序列一致性为63%，从而被选为模板用于杂合分子构建，以探讨XynBE18底物特异性的机制。利用SCHEMA软件计算略论，分别将XynE2和XynBE18分为4段和3段，通过PCR扩增、质粒重组、异源表达等过程产生出5个正突变体（E2-1、E2-2、E2-3、E2-3A、E2-3B）和3个负突变体（Ne-E2-1、Ne-E2-2、Ne-E2-3）。对野生型及突变体的底物特异性比较略论表明正突变体E2-1、E2-3、E2-3A、E2-3B的葡聚糖酶活性有明显提高，分别占木聚糖酶活性的16%、36%、35%、30%。负突变体Ne-E2-1、Ne-E2-2的葡聚糖酶活性也有提高，占木聚糖酶活性的25%、37%。E2-2与Ne-E2-3没有葡聚糖酶活性。结果表明与XynBE18底物特异性有重要相关的氨基酸位点位于其N–端和C–端，尤其是C–端的174个氨基酸中，这将有利于后期实验中关键氨基酸的确定。
在已知木聚糖相关酶基因簇（xynBE18，酯酶基因axeE18和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因abf43A）的基础上，通过TAIL-PCR的措施从该基因簇上游扩增得到了一个长3.7kb的核苷酸序列，包括一个糖苷水解酶43家族的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的编码基因（abf43B）、一个假定的转录调节子编码基因和一个假定的依赖蛋白转运系统内膜元件。本探讨对abf43A和abf43B基因进行了序列略论，构建了原核表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达、纯化及性质测定。α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶编码基因abf43B全长1821bp，翻译的氨基酸序列与已的蛋白序列一致性最高为63%。虽然Abf43A和Abf43B位于同一基因簇，只相隔17bp，并且同属于43家族，但是二者之间的相似性只有37%。重组酶Abf43A和Abf43B具有相似的最适反应pH（5.0–6.0）和最适反应温度（40–45℃），在pH3.0–8.0有很好的稳定性。在40℃处理1h后Abf43A仍能保持100%的活性，而Abf43B只剩余50%的活性。Abf43A和Abf43B的底物特异性也存在很大的异同。Abf43A不仅是一个阿拉伯呋喃糖苷酶/木糖苷酶双功能酶，同时，它还能水解小麦阿拉伯木聚糖和甜菜阿拉伯聚糖侧链上的阿拉伯糖。Abf43B只能水解人工合成底物4-硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷。
本论文就上述两个阿拉伯呋喃糖苷酶（Abf43A和Abf43B）与XynBE18针对不同底物的协同影响也进行了初步探讨。通过DNS和HPLC措施对不同底物经不同酶处理的总还原量和单糖进行了略论比较。结果表明Abf43A和Abf43B单独影响于燕麦、桦木和榉木木聚糖时没有寡糖的生成，当二者与XynBE18同时反应或以“先阿拉伯呋喃糖苷酶，后木聚糖酶”的连续反应时观察到显著的协同效果。当底物为小麦阿拉伯木聚糖时，Abf43A单独影响时能生成阿拉伯糖，与XynBE18同时影响或连续影响所生成的还原糖量都比二者单独影响时有明显增加，而Abf43B在该底物的协同反应中没有作出贡献。产物略论结果表明，在所有的协同影响中，阿拉伯语论文题目，木二糖增幅最大。
本论文初步探究了单结构域双功能木聚糖酶的底物催化机理，确定了与葡聚糖底物结合有关的关键区域，为后期关键氨基酸位点的确定和今后木聚糖酶的分子改造提供了理论基础。同时开展了木聚糖降解酶系之间协同影响的探讨，加深了对木聚糖完全降解的认识，为今后饲料及食品行业中原料酶处理过程的优化提供了很好的参考依据。
【关键词】：双功能木聚糖酶 底物影响机理 木聚糖降解基因簇 阿拉伯呋喃糖苷酶 协同影响
摘要6-8 Abstract8-14 第一章 绪论14-25 1.1 木聚糖及降解酶系14-16 1.1.1 木聚糖14-15 1.1.2 木聚糖降解酶系15 1.1.3 木聚糖降解相关酶促进底物降解的探讨概况15-16 1.2 木聚糖酶的探讨近况16-19 1.2.1 木聚糖酶的探讨概况16-17 1.2.2 木聚糖酶的结构及催化机制17-18 1.2.3 双功能木聚糖酶的探讨进展18-19 1.3 阿拉伯呋喃糖苷酶的探讨近况19-21 1.3.1 阿拉伯呋喃糖苷酶的概述19-20 1.3.2 阿拉伯呋喃糖苷酶的家族20 1.3.3 阿拉伯呋喃糖苷酶的性质20-21 1.3.4 阿拉伯呋喃糖苷酶的运用21 1.4 酶分子体外进化措施21-24 1.4.1 定点突变21-22 1.4.2 易错 PCR22 1.4.3 DNA shuffling22-23 1.4.4 SCHEMA 模块重组23-24 1.5 本探讨的目的与意义24-25 第二章 单催化域双功能木聚糖酶分子催化机理的初步探讨25-44 2.1 本章引言25 2.2 实验材料25-26 2.2.1 菌株、质粒25 2.2.2 仪器、试剂盒25-26 2.2.3 培养基26 2.2.4 引物合成、测序26 2.3 实验措施26-32 2.3.1 单功能木聚糖酶材料的搜索26 2.3.2 SCHEMA 措施预测 XynBE18、XynE2 肽段的分割点26 2.3.3 pET28a-xynBE18、pET22b-xynE2 质粒提取26-27 2.3.4 正突变体蛋白的获得27-30 2.3.5 负突变体纯蛋白的获得30-31 2.3.6 蛋白浓度标准曲线的制定31-32 2.3.7 各突变体底物特异性的测定32 2.4 结果与略论32-41 2.4.1 单功能木聚糖酶材料的搜索32-35 2.4.2 SCHEMA 措施预测 XynBE18、XynE2 肽段的分割点35 2.4.3 正突变体的扩增与重组35-36 2.4.4 正突变体蛋白的序列略论36-37 2.4.5 三个正突变体蛋白的表达、纯化37 2.4.6 三个正突变体蛋白的底物特异性测定37-38 2.4.7 E2-3 再细分的两个突变体 E2-3A、E2-3B 的扩增、重组38-39 2.4.8 E2-3A,E2-3B 的表达与纯化39 2.4.9 负突变体蛋白的序列略论39-41 2.4.10 负突变体蛋白的表达与纯化41 2.4.11 所有突变体的底物特异性比较41 2.5 讨论41-42 2.6 后续工作42-43 本章小结43-44 第三章 Paenibacillus sp. E18 木聚糖降解酶系的基因克隆、表达与协同影响44-68 3.1 本章引言44 3.2 实验材料44-46 3.2.1 菌株、质粒44 3.2.2 仪器、试剂44-45 3.2.3 培养基与溶液配制45 3.2.4 底物配制45 3.2.5 引物合成、测序45-46 3.3 实验措施46-55 3.3.1 木聚糖酶系基因簇上游序列的基因克隆46-48 3.3.2 两个阿拉伯呋喃糖苷酶 Abf43A 和 Abf43B 的异源表达、纯化48-52 3.3.3 两个阿拉伯呋喃糖苷酶的性质测定52-54 3.3.4 阿拉伯呋喃糖苷酶与木聚糖酶的协同影响54-55 3.4 结果与略论55-66 3.4.1 基因簇上游基因的克隆55-57 3.4.2 阿拉伯呋喃糖苷酶 Abf43B 的序列略论57-58 3.4.3 对硝基酚标准曲线的制定58 3.4.4 阿拉伯糖标准曲线的制定58-59 3.4.5 pET28a(/)-abf43A 与 pET28a(/)-abf43B 的质粒构建59 3.4.6 阿拉伯呋喃糖苷酶 Abf43A 与 Abf43B 的异源表达59-60 3.4.7 pH 和温度对 Abf43A 和 Abf43B 酶活性的作用60-61 3.4.8 Abf43A 和 Abf43B 的底物特异性及比活力61-62 3.4.9 动力学常数的测定62 3.4.10 阿拉伯呋喃糖苷酶与木聚糖酶的协同影响62-64 3.4.11 协同影响生成寡糖的 HPLC 略论64-66 3.5 讨论66-67 本章小结67-68 第四章 全文结论68-69 |
