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【摘要】：阿拉伯半乳糖蛋白(arabinogalactan proteins, AGPs)是一类广泛分布于植物界的糖蛋白。已有探讨表明,阿拉伯半乳糖蛋白在植物生长发育的不同时期起着重要影响。根据阿拉伯半乳糖蛋白的蛋白骨架特点,预测模式生物拟南芥中存在大约85个AGP基因。本文利用生物信息学、半定量及定量RT-PCR、RNAi和过表达、启动子融合及亚细胞定位载体的构建、浸花法转化拟南芥等一系列分子生物学及细胞生物学措施,对At FLA 3的表达模式、细胞亚定位及生物学功能进行了详细的探讨,探讨结果如下：
1、AtFLA3序列的生物信息学略论表明,该基因cDNA包含一个843bp的开放阅读框,编码具有280个氨基酸的蛋白；并且AtFLA3具有4个含量丰富的氨基酸包括：脯氨酸(Pro)(10.71%),丙氨酸(Ala)(10.71%),丝氨酸(Ser)(10.36%)和苏氨酸(Thr)(6.79%)。其编码成熟蛋白前体具有4个不同的区域：一个N-端分泌信号,一个位于中间的、典型的、富含羟脯氨酸/脯氨酸的AGP结构域,一个类成束蛋白结构域(fasciclin-like domain)和一个C-端疏水的GPI(甘油磷酸肌醇)加锚信号。前体蛋白的第24和第25位氨基酸之间为N-端信号肽切割位点。第256位的“Ser”氨基酸为C-端甘油磷酸肌醇加尾信号的修饰位点。拟南芥基因芯片ATH1及MPSS略论表明,AtFLA3主要在花序中表达。
2、定量PCR的结果表明,AtFLA3在花器官中特异表达,且该基因的表达明显受到光的调控。利用PLACE等一些网上启动子顺式元件的预测工具对AtFLA3的5’上游启动子序列进行预测,发现该启动子中含有许多真核生物顺式元件的同源序列,如与光应答、激素应答及非生物胁迫应答等相关的元件。特别是其中含有晚期花粉基因LAT52和G10的"POLLEN1LELAT52"及"GTGANTG10"的顺式调控元件,这些元件特异地在成熟花粉中起影响。我们构建了AtFLA3启动子与GUS基因融合表达载体,通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥植株,抗性筛选和PCR验证获得纯合的启动子与GUS融合的转基因株系。GUS染色结果显示,在AtFLA3启动子的驱动下,GUS在花药、成熟花粉及花粉管中特异表达,并且主要从第10时期的花(花期10)开始一直到第13时期的花(花期13)。花期13的柱头和引导组织中染色信号较强,但这些信号均来自于萌发的花粉管。GUS染色后的花器官半薄切片结果进一步证实AtFLA3在花粉中特异表达。
3、利用基因工程手段构建eGFP (enhanced green fluorescence)报告基因分别与AtFLA3全长ORF(开放阅读框)序列和缺失C-端GPI加锚信号序列的两种融合表达载体。农杆菌介导的浸花法将eGFPm-AtFLA3和eGFPm-AtFLA3△GPI转化拟南芥。利用激光共聚焦显微技术观察这两种融合蛋白在纯合转基因幼苗胚轴细胞的亚细胞定位情况,结果表明AtFLA3定位在细胞质膜上,而且C-端GPI加锚信号序列可能作用了该蛋白在细胞质膜上的正确定位。
4、对AtFLA3的T-DNA插入突变体SALK_016582的略论表明,该突变体T-DNA的插入位于该基因的3’非编码区。通过三引物基因组PCR法鉴定纯合的SALK_016582突变体。RNA水平鉴定表明,该突变体的T-DNA插入对编码区的表达并无作用。SALK_016582纯合突变体与野生型植株相比,其表型无明显异同。
5、利用RNAi与过量表达技术探讨了AtFLA3的生物学功能。分别构建了AtFLA3的RNAi载体和过量表达载体,通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥植株。RNAi和过表达转基因株系与野生型植株的比较观察,发现AtFLA3的沉默和过表达均能导致角果败育。进一步的探讨表明,AtFLA3的沉默导致成熟花粉中出现许多体积小且畸形花粉。FDA (fluorescin diacetate)及12-KI染色结果表明,这些异常的花粉无生活力,而且RNAi株系与野生型植株的互交实验证实,在该基因沉默株系中花粉异常是导致角果败育的主要原因。花药半薄及超薄切片的观察发现,RNAi异常花粉内壁具有缺陷,且该缺陷从单核小孢子到二核花粉过渡时期便已产生。花粉的CW (calcofluor white)染色结果表明,RNAi异常花粉中纤维素物质沉积异常,这可能引起了RNAi异常花粉内壁的缺陷,并最终导致花粉败育。由此可见,AtFLA3在花粉发育过程中起重要影响,特别是参与花粉内壁的形成。
然而,在过表达植株中,成熟花粉的形态、生活力及萌发效率均正常,但花丝变短、雌蕊组织的缺陷可能是导致过表达植株败育的主要原因。
【关键词】：拟南芥 FLA3 RNA干扰 过量表达 花粉发育 花粉内壁
摘要5-8 ABSTRACT8-11 缩写符号11-18 第一章 前言18-47 1.1 AGPs的分子模型及结构特点18-22 1.2 AGPs生理生化特性及其常用的细胞学探讨措施22-25 1.3 AGPs生物学功能的探讨进展25-34 1.4 花粉发育过程及成熟花粉结构特点34-39 1.5 花粉发育相关探讨的进展39-45 1.6 小结45-47 第二章 拟南芥AtFLA3生物信息学略论47-67 2.1 前言47-50 2.2 材料和措施50-52 2.2.1 实验材料50 2.2.1.1 生物信息学相关网站及软件50 2.2.1.2 实验对象50 2.2.2 实验措施50-52 2.2.2.1 序列比对及系统进化树的绘制50-51 2.2.2.2 MPSS和microarray数据略论51 2.2.2.3 氨基酸序列信息略论51 2.2.2.4 N-信号肽预测51 2.2.2.5 GPI加锚信号预测51-52 2.2.2.6 启动子顺式调控元件预测52 2.2.2.7 蛋白亚定位预测52 2.3 结果52-66 2.3.1 AGPs基因序列比对、进化树绘制及亲缘关系的略论52-56 2.3.2 拟南芥AGPs基因的基因芯片及MPSS数据略论56-61 2.3.3 AtFLA3核酸及氨基酸序列信息略论61-62 2.3.4 AtFLA3的N-信号肽预测62-63 2.3.5 AtFLA3的GPI加锚信号预测63-64 2.3.6 AtFLA3启动子顺式调控元件预测64-65 2.3.7 AtFLA3的亚细胞定位预测65-66 2.4 讨论66-67 第三章 拟南芥AtFLA3的表达略论67-95 3.1 前言67-73 3.2 材料与措施73-90 3.2.1 实验材料73-76 3.2.1.1 植物材料73 3.2.1.2 菌株和载体73 3.2.1.3 化学试剂和溶液73-76 3.2.3 实验措施76-90 3.2.3.1 各种外源因子处理花序的措施76-77 3.2.3.2 半定量及定量PCR77-82 3.2.3.2.1 总RNA(ribonucleic acid)抽提77-79 3.2.3.2.2 RNA的反转录79-80 3.2.3.2.3 引物设计80 3.2.3.2.4 半定量及定量PCR反应80-82 3.2.3.3 启动子与GUS融合表达载体的遗传转化82-89 3.2.3.3.1 生物信息学预测启动子序列及顺式调控元件略论83 3.2.3.3.2 基因组抽提及PCR扩增全长启动子序列83 3.2.3.3.3 启动子与GUS融合表达载体的构建83-84 3.2.3.3.4 CaCl_2法大肠杆菌感受态细胞制备及转化84-85 3.2.3.3.5 碱裂解法提取质粒85-86 3.2.3.3.6 质粒DNA的电泳、PCR和酶切检测及测序验证86 3.2.3.3.7 农杆菌菌株GV3101感受态制备、转化及PCR检测86-87 3.2.3.3.8 农杆菌介导的浸花法转化拟南芥植株87-88 3.2.3.3.9 拟南芥T_0代种子的抗性筛选与幼苗移栽88 3.2.3.3.10 拟南芥T_1代抗性植株的基因组水平鉴定88-89 3.2.3.3.11 拟南芥T_3代转基因纯合株系的获得89 3.2.3.4 GUS染色略论89 3.2.3.4.1 GUS染色液及透明剂的配制89 3.2.3.5 树脂包埋与半薄切片89-90 3.3 结果90-93 3.3.1 AtFLA3在花器官中特异表达90-91 3.3.2 AtFLA3的表达受到光的调控91 3.3.3 pAtFLA3::GUS转基因株系的GUS表达91-93 3.4 讨论93-95 第四章 AtFLA3亚细胞定位探讨95-106 4.1 前言95-98 4.2 材料与措施98-101 4.2.1 实验材料98 4.2.1.1 植物材料98 4.2.1.2 菌株和载体98 4.2.1.3 主要试剂98 4.2.1.4 主要培养基及配方98 4.2.2 实验措施98-101 4.2.2.1 亚细胞定位载体的构建98-100 4.2.2.1.1 N 端信号肽及GPI加锚信号的预测98-99 4.2.2.1.2 引物设计99 4.2.2.1.3 重组载体构建及载体检测99-100 4.2.2.2 重组载体的遗传转化100 4.2.2.3 阳性纯合转基因株系的筛选及鉴定100 4.2.2.4 转基因植株下胚轴细胞的荧光检测100-101 4.3 结果101-103 4.3.1 eGFPm-AtFLA3及eGFPm-AtFLA3△GPI重组载体构建101-102 4.3.2 eGFPm-AtFLA3及eGFPm-AtFLA3△GPI转基因植株的基因组水平鉴定102-103 4.3.3 eGFPm-AtFLA3及eGFPm-AtFLA3△GPI在纯合转基因幼苗下胚轴细胞中的定位103 4.4 讨论103-106 4.4.1 生物信息学预测的准确性103 4.4.2 不同转化系统及优缺点103-104 4.4.3 使用eGFP定位蛋白的优缺点104 4.4.4 AGPs蛋白定位的相关探讨104-105 4.4.5 AtFLA3亚细胞定位及GPI锚在蛋白定位中的影响105-106 第五章 AtFLA3的生物学功能探讨106-135 5.1 前言106-109 5.2 材料与措施109-123 5.2.1 实验材料109-111 5.2.1.1 植物材料109 5.2.1.2 菌株和载体109-110 5.2.1.3 主要试剂110 5.2.1.4 常用培养基和抗生素110-111 5.2.2 实验措施111-123 5.2.2.1 T-DNA突变体纯合鉴定及表型观察111-114 5.2.2.1.1 T-DNA纯合插入突变体鉴定引物的设计111 5.2.2.1.2 小量基因组的提取111 5.2.2.1.3 三引物法鉴定纯合突变体株系111-113 5.2.2.1.4 T-DNA纯合插入突变体RNA水平的鉴定113-114 5.2.2.1.5 T-DNA纯合插入突变体表型观察114 5.2.2.2 过量表达载体的构建114 5.2.2.3 利用RNA干扰技术探讨基因的生物学功能114-123 5.2.2.3.1 RNAi载体的构建及遗传转化114-115 5.2.2.3.2 RNAi阳性转基因株系的筛选及鉴定115 5.2.2.3.3 RNAi转基因株系的表型观察及略论115-123 5.2.2.3.3.1 RNAi转基因株系形态观察115 5.2.2.3.3.2 成熟角果中可育胚珠数目统计措施115 5.2.2.3.3.3 花及花粉形态观察115-116 5.2.2.3.3.4 FDA(fluorescin diacetate)染色措施116 5.2.2.3.3.5 碘-碘化钾染色措施116 5.2.2.3.3.6 花粉体外萌发及萌发率统计措施116-117 5.2.2.3.3.7 杂交实验117 5.2.2.3.3.8 DAPI染色措施117-118 5.2.2.3.3.9 CW染色措施118 5.2.2.3.3.10 果胶单克隆抗体JIM5和JIM7的免疫荧光技术118-119 5.2.2.3.3.11 花粉管脱色苯胺蓝染色措施119 5.2.2.3.3.12 半薄切片和超薄切片措施119-120 5.2.2.3.3.13 上下游相关基因的PCR略论120-123 5.3 结果123-132 5.3.1 SALK_016582纯合插入突变体的鉴定及表型略论123 5.3.2 AtFLA3 RNAi载体构建,转基因株系的鉴定及表型略论123-130 5.3.2.1 RNAi载体的构建123-125 5.3.2.2 阳性转基因株系的鉴定125-127 5.3.2.3 RNAi植株的表型127 5.3.2.4 RNAi植株的花粉活力略论127 5.3.2.5 RNAi植株的花粉体外萌发及萌发率127 5.3.2.6 互交实验略论RNAi株系败育的原因127-128 5.3.2.7 花药半薄切片结构的观察128 5.3.2.8 花粉超微结构的观察128 5.3.2.9 花粉壁中纤维素及果胶定位128-129 5.3.2.10 上下游相关基因的表达略论129-130 5.3.3 AtFLA3过量表达载体的构建,转基因株系的鉴定130-132 5.4 讨论132-135 5.4.1 AtFLA3是拟南芥花粉内壁形成所必需132-134 5.4.2 AtFLA3可能受到一些花粉发育相关基因的调控134-135 第六章 总讨论135-139 参考文献139-162 图版及图版说明162-181 在读期间的论文181-182 ，阿拉伯语论文题目，阿拉伯语论文 |
