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【摘要】：
植物细胞壁主要由纤维素、交联多糖、果胶质和蛋白质组成，大多数细胞壁蛋白属于大的蛋白质家族，包括酶、膨胀素(expansins)、细胞壁相关激酶以及富含Hyp的糖蛋白(Hyp-richglycoproteins，HRGPs)。阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGPs，Arabinogalactan proteins)是HRGPs家族中的亚家族，在拟南芥中，GPI(glycosylphosphatidylinositol，糖基磷脂酰肌醇)锚定的AGPs可以被分成四个亚类，其中FLAs(fasciclin-like arabinogalactan protein，类成束蛋白阿拉伯半乳聚糖蛋白)是阿拉伯半乳聚糖蛋白中的一类，它不仅包含有类AGP的糖基化区域，而且还存在1～4个fasciclin-like结构域。
已有的探讨表明，阿拉伯半乳聚糖蛋白基因以两种基本的方式参与植物细胞的生长，即扩散生长(diffuse expansion)和顶端生长(tip growth)。为了验证从棉花纤维文库中克隆的一个阿拉伯半乳聚糖蛋白基因GhFLA(fasciclin-like arabinogalactan)的功能，我们通过农杆菌介导法将该基因转入烟草和棉花中超量表达，获得的主要结果如下：
1．GhFLA基因的克隆及特性略论
从棉花纤维发育早期cDNA文库中随机克隆的GhFLA cDNA全长1485 bp，其中包含一个长1194 bp的ORF和一个长291 bp的3′-UTR。推测的蛋白质序列包含397个氨基酸残基，分子量为42.8 kDa。经比对发现，GhFLA蛋白与拟南芥FLA2、FLA1和一个推测的水稻胚乳特异蛋白SC3同源，阿拉伯语论文题目，相同氨基酸比例分别达到62％(250／397)、55％(231／416)和53％(190／352)。序列略论表明GhFLA蛋白含有N-末端信号肽序列和C-末端GPI-锚定信号序列，阿拉伯语论文范文，蛋白骨架含有类成束蛋白(fasciclin-like)结构域和阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGP-like)结构域。Northern杂交略论结果显示该基因在棉花的根、胚珠及快速伸长期纤维(5～15DPA)中优势表达，而在棉花的茎、叶和花中未检测到信号，GhFLA在纤维中的表达量随着开花后天数的增加而逐渐提高，在第12d的纤维中达到最高峰。
2．AGPs的抑制剂Yariv试剂能够抑制陆地棉的根和纤维的伸长
由于GhFLA在棉花的根和快速伸长期的纤维中高丰度表达，因而很可能该基因对棉花的根和纤维的伸长有影响。所以我们考察了AGPs的专一抑制剂Yariv试剂对棉花的根和纤维伸长的作用。在分别添加有10、30μmol／L Yariv试剂的培养基中生长的棉花，7d内根的伸长量分别比对照下降了42％和46％。野生型徐州142棉花0 DPA胚珠在添加10μmol／L Yariv试剂的BT培养基中培养14d后，结果显示胚珠的纤维长度比对照明显降低，而胚珠的大小和形状并无可见的异同。这两方面的结果暗示了阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGPs)可能能够促进棉花的根和纤维的伸长。
3．超量表达GhFLA基因促进烟草种子提早萌发
为了探讨棉花GhFLA基因的功能，我们构建了超量表达GhFLA基因的植物表达载体，利用农杆菌介导法转入K326烟草。通过Km抗性转筛选、GUS染色鉴定和RT-PCR略论。最终选择了超量表达GhFLA基因的烟草株系3个。
超量表达GhFLA基因的T_0代烟草种子在播种后第40hr的时候已经开始萌发，而对照的种子则基本没有萌动。到第48hr的时候，转基因株系6~#、8~#和24~#的萌发率分别比对照高出19.67％、19.56％和36.30％，而到第84hr的时候，转基因烟草种子的萌发率与对照达到同等水平。这说明GhFLA基因在烟草中的表达促进了烟草种子提早萌发。
4．超量表达GhFLA基因对棉花纤维的长度、衣分和根伸长速率的作用
为了验证棉花阿拉伯半乳聚糖蛋白基因GhFLA是否能够促进棉纤维和根的伸长，我们通过农杆菌介导法将其转入到棉花中。结果显示，超量表达GhFLA基因的T_0代棉花纤维长度在25.5～27.4mm之间，而对照棉花纤维的长度为25.5mm，转基因棉花纤维衣分在40％～44％之间，对照的衣分为40％。24hr内转基因T_1代植株FLA5-1和FLA5-2的根伸长量分别比对照的22.6mm下降了3.3mm和3.9mm，而FLA3-1的转基因棉花根伸长量比对照高出1.4mm。但是转基因棉花根伸长速率的变化程度与GhFLA基因的表达量关系上并不一致，因而可能超量表达GhFLA基因对T_0代棉花纤维的长度、衣分和对T_1代棉花的根伸长速率没有明显的作用。由于转基因植株中的杂合基因可能表现不出明显的表型，所以仍然需要对转基因植株的分离世代作进一步略论探讨。
【关键词】：棉花 纤维 类成束蛋白阿拉伯半乳聚糖蛋白 种子萌发 根伸长
摘要7-9 Abstract9-11 一、文献综述11-20 1.1 棉花探讨近况11-13 1.1.1 棉花概述11 1.1.2 棉花纤维分子生物学探讨的意义11 1.1.3 棉花纤维的发育过程11-12 1.1.4 棉花的遗传转化与胚珠培养12-13 1.2 阿拉伯半乳聚糖蛋白基因的探讨进展13-18 1.2.1 AGPs的分类、化学组成与结构13-14 1.2.2 AGPs的翻译后修饰与加工14 1.2.3 AGPs与细胞壁、质膜和细胞骨架成分的相互影响14-15 1.2.4 AGPs参与生长调节15-16 1.2.5 AGPs与体细胞胚发生16-17 1.2.6 AGPs的其他功能17-18 1.3 FLA蛋白探讨进展18-20 二、引言20-22 2.1 论文的立论依据20-21 2.2 论文的技术路线21-22 三、材料与措施22-28 3.1 材料22-24 3.1.1 植物材料22 3.1.2 菌株与载体22 3.1.3 主要仪器与试剂22 3.1.4 主要缓冲液配方22-24 3.2 措施24-28 3.2.1 基因克隆及其在棉花中的表达略论24 3.2.2 蛋白序列略论与结构预测24-25 3.2.3 Yariv试剂的制备25 3.2.4 Yariv试剂对棉花根伸长和胚珠纤维的影响25 3.2.5 植物超量表达载体的构建25-26 3.2.6 烟草的遗传转化26 3.2.7 棉花的遗传转化26-27 3.2.8 转基因烟草及棉花的RT-PCR略论27 3.2.9 烟草萌发率与根伸长速率测定27-28 四、结果与略论28-39 4.1 GhFLA的序列略论28-30 4.2 GhFLA的表达略论30 4.3 GhFLA蛋白的结构域预测30-31 4.4 AGPs抑制剂Yariv试剂能抑制棉花根和纤维的伸长31-33 4.5 GhFLA植物超量表达载体的构建33-34 4.6 超量表达GhFLA基因烟草的获得34 4.7 超量表达GhFLA基因促进烟草种子提早萌发34-36 4.8 转基因棉花的获得与RT-PCR略论36-37 4.9 超量表达GhFLA基因对棉花纤维的长度、衣分和根伸长速率的作用37-39 五、讨论39-42 5.1 Yariv试剂对探讨AGPs蛋白质功能的影响39 5.2 AGPs参与种子的萌发39-40 5.3 AGPs与细胞的生长调节40-42 六、结论42-43 七、参考文献43-47 缩略词表47-48 致谢48-49 期间论文及参加课题49 |
